2707 スーパー二相ステンレス鋼の微生物腐食に対する緑膿菌海洋バイオフィルムの影響

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微生物による腐食 (MIC) は、多大な経済的損失につながる可能性があるため、多くの業界で大きな問題となっています。スーパー二相ステンレス鋼 2707 (2707 HDSS) は、優れた耐薬品性に​​より海洋環境で使用されます。しかし、MIC に対する耐性は実験的に証明されていません。この研究では、海洋好気性細菌である緑膿菌によって引き起こされる MIC 2707 HDSS の挙動を調べました。電気化学分析により、2216E 培地中に緑膿菌バイオフィルムが存在すると、腐食電位がプラスに変化し、腐食電流密度が増加することが示されました。X 線光電子分光法 (XPS) 分析の結果、バイオフィルムの下のサンプル表面の Cr 含有量の減少が示されました。ピット画像の分析により、緑膿菌バイオフィルムは、培養 14 日後に最大​​ 0.69 μm のピット深さを生成したことが示されました。これは小さいですが、2707 HDSS が MIC に対する緑膿菌バイオフィルムの影響を完全に受けていないことを示唆しています。
二相ステンレス鋼 (DSS) は、優れた機械的特性と耐食性の完璧な組み合わせにより、さまざまな業界で広く使用されています1、2。ただし、局所的な孔食が依然として発生する可能性があり、この鋼の完全性に影響を与える可能性があります 3、4 。DSS は微生物腐食 (MIC) から保護されていません 5、6。DSS の適用範囲は非常に広いですが、DSS の耐食性が長期間の使用に十分ではない環境もまだ存在します。これは、より高い耐食性を備えたより高価な材料が必要であることを意味します。Jeon et al.7 は、超二相ステンレス鋼 (SDSS) であっても耐食性の点でいくつかの制限があることを発見しました。したがって、特定の用途ではより高い耐食性を備えたスーパー二相ステンレス鋼 (HDSS) が必要とされています。これが、高合金化 HDSS の開発につながりました。
DSS の耐食性は、α 相と γ 相の比率、および二次相に隣接する Cr、Mo、W が欠乏した領域によって決まります 8、9、10。HDSS には Cr、Mo、N11 が高含有されているため、優れた耐食性と、重量% Cr + 3.3 (重量% Mo) で定義される高い値 (45 ～ 50) の等価孔食抵抗値 (PREN) が得られます。 + 0、5 wt % (W) + 16 wt %。N12.その優れた耐食性は、約 50% のフェライト (α) 相と 50% のオーステナイト (γ) 相を含むバランスの取れた組成に依存します。HDSS は、従来の DSS13 と比較して機械的特性が向上し、耐塩素性が高くなります。化学腐食の特徴。耐食性の向上により、海洋環境などのより攻撃的な塩化物環境での HDSS の使用が拡張されます。
MIC は、石油、ガス、水道供給を含む多くの業界で重大な問題となっています14。MIC はすべての腐食損傷の 20% を占めます15。MIC は、多くの環境で観察される生物電気化学的腐食です16。金属表面にバイオフィルムが形成されると電気化学的条件が変化し、腐食プロセスに影響を与えます。MIC 腐食はバイオフィルムによって引き起こされることが一般に受け入れられています 14。電磁微生物は、生存のためのエネルギーを得るために金属を食い荒らします17。最近の MIC 研究では、EET (細胞外電子伝達) が起電性微生物によって誘発される MIC の制限因子であることが示されています。Zhang et al.18 は、電子メディエーターが Desulfovibrio vulgaris 固着細胞と 304 ステンレス鋼の間の電子伝達を加速し、より深刻な MIC 攻撃を引き起こすことを実証しました。アニングら。19およびWenzlaffら。研究者らは、腐食性硫酸塩還元細菌 (SRB) のバイオフィルムが金属基板から直接電子を吸収し、その結果、深刻な孔食が発生する可能性があることを示しています。
DSS は、SRB、鉄還元細菌 (IRB) などを含む培地中で MIC の影響を受けやすいことが知られています 21 。これらの細菌は、バイオフィルムの下の DSS 表面に局所的な孔食を引き起こします 22,23。DSS とは異なり、MIC HDSS24 についてはほとんど知られていません。
緑膿菌は、自然界に広く分布しているグラム陰性の運動性の桿菌です25。緑膿菌は、海洋環境における鉄鋼の MIC に関与する主要な微生物叢でもあります 26。シュードモナス種は腐食プロセスに直接関与しており、バイオフィルム形成中の最初の定着者として認識されています27。マハトら。28およびユアンら。２９は、緑膿菌が水生環境において軟鋼および合金の腐食速度を増加させる傾向があることを実証した。
この研究の主な目的は、電気化学的方法、表面分析方法、および腐食生成物分析を使用して、海洋好気性細菌である緑膿菌によって引き起こされる 2707 HDSS の MIC 特性を研究することです。MIC 2707 HDSS の動作を研究するために、開回路電位 (OCP)、直線分極抵抗 (LPR)、電気化学インピーダンス分光法 (EIS)、動的電位分極などの電気化学的研究が実行されました。エネルギー分散分光法 (EDS) 分析は、腐食表面の化学元素を検出するために実行されます。さらに、緑膿菌を含む海洋環境の影響下での酸化膜不動態化の安定性を、X 線光電子分光法 (XPS) によって測定しました。ピットの深さは、共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM) で測定されました。
表 1 に 2707 HDSS の化学組成を示します。表 2 は、2707 HDSS が降伏強度 650 MPa の優れた機械的特性を備えていることを示しています。図上。図１は、溶体化熱処理された２７０７ ＨＤＳＳの光学的微細構造を示す。約 50% のオーステナイト相と 50% のフェライト相を含む微細構造では、二次相のないオーステナイト相とフェライト相の細長いバンドが見られます。
図上。図２ａは、２２１６Ｅ非生物培地および緑膿菌ブロス中の２７０７ ＨＤＳＳについて、３７℃で１４日間曝露した時間に対する開路電位（Ｅｏｃｐ）を示す。Eocp の最も顕著な変化は最初の 24 時間に発生することがわかりました。どちらの場合の Eocp 値も、約 16 時間で約 -145 mV (対 SCE) でピークに達し、その後、非生物サンプルでは -477 mV (対 SCE) および -236 mV (対 SCE) に、相対サンプルでは P に急激に低下しました。 SCE) 緑青の葉、それぞれ。24 時間後、緑膿菌 2707 HDSS の Eocp 値は -228 mV (SCE と比較) で比較的安定したままでしたが、非生物サンプルの対応する値は約 -442 mV (SCE と比較) でした。緑膿菌の存在下での Eocp は非常に低かった。
37℃での非生物培地および緑膿菌ブロス中での 2707 個の HDSS サンプルの電気化学的試験:
(a) 曝露時間に伴う Eocp の変化、(b) 14 日目の分極曲線、(c) 曝露時間に伴う Rp の変化、(d) 曝露時間に伴う Corr の変化。
表 3 は、14 日間にわたって非生物および緑膿菌が接種された培地に曝露された 2707 個の HDSS サンプルの電気化学的腐食パラメーターを示しています。陽極曲線と陰極曲線の交点への接線外挿により、標準的な方法に従って腐食電流密度 (icorr)、腐食電位 (Ecorr)、およびターフェル勾配 (βα および βc) を決定することができました 30,31。
図 2b に示すように、緑膿菌の曲線の上方シフトにより、非生物的な曲線と比較して Ecorr が増加しました。緑膿菌を含むサンプルの icorr 値は、腐食速度に比例して 0.328 μA cm-2 まで増加しました。これは、非生物サンプル (0.087 μA cm-2) の 4 倍です。
LPR は、腐食を非破壊で高速分析するための古典的な電気化学的手法です。MIC32 の研究にも使用されています。図上。図２ｃは、露光時間に応じた分極抵抗（Ｒｐ）の変化を示す。Rp 値が高いほど、腐食が少ないことを意味します。最初の 24 時間以内に、Rp 2707 HDSS は、非生物標本では 1955 kΩ cm2、緑膿菌標本では 1429 kΩ cm2 でピークに達しました。図 2c は、Rp 値が 1 日後に急速に減少し、その後 13 日間は比較的変化しないことも示しています。緑膿菌試験片の Rp 値は約 40 kΩ cm2 であり、非生物学的試験片の 450 kΩ cm2 よりもはるかに低くなります。
icorr の値は均一腐食速度に比例します。その値は、次の Stern-Giri 方程式から計算できます。
ゾーイらによると、この研究では、ターフェル勾配 B は 26 mV/dec の代表値として採用されました。図上。２ｄは、２７０７非生物株のｉｃｏｒｒが比較的安定したままであるのに対し、緑膿菌バンドのｉｃｏｒｒは最初の２４時間後に大きく変動し、大きく変動したことを示している。緑膿菌試験サンプルの icorr 値は、非生物学的対照の値よりも 1 桁高かった。この傾向は、分極抵抗の結果と一致しています。
EIS は、腐食界面での電気化学反応を特徴付けるために使用されるもう 1 つの非破壊的な方法です 34。非生物媒体および緑膿菌の溶液に曝露されたストリップのインピーダンススペクトルおよび静電容量の計算。Rb はストリップの表面に形成された不動態/バイオフィルムの抵抗、Rct は電荷移動抵抗、Cdl は電気二重層です。) および QCPE 定位相要素 (CPE) パラメーター。これらのパラメータは、データを等価電気回路 (EEC) モデルと比較することによってさらに分析されました。
図上。図３は、非生物培地および緑膿菌ブロス中の２７０７個のＨＤＳＳサンプルの様々なインキュベーション時間における典型的なナイキストプロット（ａおよびｂ）およびボードプロット（ａ'およびｂ'）を示す。緑膿菌が存在すると、ナイキスト ループの直径が減少します。ボード線図 (図 3b') は、総インピーダンスの増加を示しています。緩和時定数に関する情報は、位相最大値から取得できます。図上。図４は、物理構造と、単層（ａ）および２層（ｂ）に基づく対応するＥＥＣを示す。CPE は EEC モデルに導入されています。そのアドミッタンスとインピーダンスは次のように表されます。
2707 HDSS クーポン インピーダンス スペクトルをフィッティングするための 2 つの物理モデルと対応する等価回路:
ここで、Y0 は CPE の大きさ、j は虚数または (-1)1/2、ω は角周波数、n は 1 未満の CPE 力率です 35。電荷移動抵抗の反転 (つまり 1/Rct) は腐食速度に対応します。Rct 値が低いほど、腐食速度が高いことを意味します27。14 日間のインキュベーション後、緑膿菌の試験サンプルの Rct は 32 kΩ cm2 に達しました。これは、非生物学的試験サンプルの 489 kΩ cm2 よりもはるかに小さいです (表 4)。
図のCLSM画像とSEM画像。図５は、ＨＤＳＳサンプル２７０７の表面上のバイオフィルム被覆が７日後に非常に密になったことを明確に示している。しかし、14日後、バイオフィルムコーティングはまばらになり、死んだ細胞がいくつか現れました。表 5 は、緑膿菌に 7 日間および 14 日間曝露した後の 2707 個の HDSS サンプルのバイオフィルムの厚さを示しています。バイオフィルムの最大厚さは、7 日後の 23.4 μm から 14 日後の 18.9 μm に変化しました。平均バイオフィルム厚さでもこの傾向が確認されました。７日後の２２．２±０．７μｍから１４日後の１７．８±１．０μｍまで減少した。
(a) 7 日目の 3-D CLSM 画像、(b) 14 日目の 3-D CLSM 画像、(c) 7 日目の SEM 画像、(d) 14 日目の SEM 画像。
EMF により、緑膿菌に 14 日間曝露されたサンプルのバイオフィルム内の化学元素と腐食生成物が明らかになりました。図上。図 6 は、バイオ フィルムおよび腐食生成物中の C、N、O、P の含有量が純粋な金属よりもはるかに高いことを示しています。これらの元素はバイオ フィルムとその代謝物に関連しているためです。微生物は微量の Cr と Fe のみを必要とします。バイオフィルム中の Cr と Fe の含有量が高いこと、およびサンプル表面の腐食生成物は、腐食の結果として金属マトリックス内の元素が失われたことを示しています。
14日後、培地2216Eで緑膿菌のあるピットとないピットが観察された。インキュベーション前、サンプルの表面は滑らかで欠陥はありませんでした (図 7a)。図 7b と c に示すように、インキュベーションしてバイオフィルムと腐食生成物を除去した後、CLSM を使用してサンプル表面の最も深いピットを検査しました。非生物学的対照の表面には明らかな窪みは見られませんでした (最大窪み深さ 0.02 μm)。緑膿菌によって引き起こされた最大のくぼみの深さは、3 つのサンプルからの最大のくぼみの深さの平均に基づいて、7 日後に 0.52 μm、14 日後に 0.69 μm であり (サンプルごとに 10 の最大のくぼみの深さが選択されました)、0.42 ± 0.12 μm に達しました。 。それぞれ、0.52 ± 0.15 μm (表 5)。これらのディンプル深さの値は小さいですが重要です。
(a) 暴露前。(b) 非生物的環境で 14 日間。(c) 緑膿菌ブロス中で 14 日間。
図上。表 8 は、さまざまなサンプル表面の XPS スペクトルを示し、各表面について分析された化学的性質を表 6 にまとめています。 表 6 では、Fe および Cr の原子百分率は、緑膿菌の存在下ではるかに低くなりました (サンプル A および B) ）非生物学的コントロールストリップよりも優れています。(サンプルCおよびD)。緑膿菌のサンプルについては、Cr 2p コア レベルのスペクトル曲線を、結合エネルギー (BE) 574.4、576.6、578.3、および 586.8 eV の 4 つのピーク成分に当てはめました。これらの成分は、Cr、Cr2O3、CrO3、および Cr(OH) に割り当てられました。それぞれ３（図９ａおよびｂ）。非生物学的サンプルの場合、図1および2のコアレベルCr 2pのスペクトルは次のようになります。図９ｃおよびｄは、それぞれＣｒ（ＢＥ ５７３．８０ｅＶ）およびＣｒ ２ Ｏ ３ （ＢＥ ５７５．９０ｅＶ）の２つの主ピークを含む。非生物クーポンと緑膿菌クーポンの最も顕著な違いは、バイオフィルムの下に Cr6+ と比較的高い割合の Cr(OH)3 (BE 586.8 eV) が存在することでした。
2 つの培地でそれぞれ 7 日間および 14 日間保存した 2707 個の HDSS サンプルの広表面 XPS スペクトル。
(a) 7 日間の緑膿菌への曝露、(b) 14 日間の緑膿菌への曝露、(c) 7 日間の非生物的曝露、(d) 14 日間の非生物的曝露。
HDSS は、ほとんどの環境で高いレベルの耐食性を示します。Kim ら 2 は、HDSS UNS S32707 は PREN が 45 を超える高濃度ドープ DSS であると特定されたと報告しました。この研究における HDSS サンプル 2707 の PREN 値は 49 でした。これは、高い Cr 含有量と高レベルの Mo およびNi。酸性環境や塩化物の含有量が高い環境で役立ちます。さらに、バランスの取れた組成と欠陥のない微細構造により、構造安定性と耐食性が実現します。優れた耐薬品性に​​もかかわらず、この研究の実験データは、2707 HDSS が緑膿菌バイオフィルム MIC に対して完全に免疫があるわけではないことを示しています。
電気化学的結果は、緑膿菌ブロス中の 2707 HDSS の腐食速度が、非生物学的環境と比較して 14 日後に大幅に増加したことを示しました。図 2a では、最初の 24 時間で非生物培地と緑膿菌培養液の両方で Eocp の減少が観察されました。その後、バイオフィルムはサンプルの表面を覆い終え、Eocp は比較的安定になります。しかし、生物の Eocp レベルは非生物の Eocp レベルよりもはるかに高かった。この違いが緑膿菌バイオフィルムの形成に関連していると考える理由があります。図上。2g では、緑膿菌の存在下で 2707 HDSS の icorr 値は 0.627 μA cm-2 に達しました。これは非生物学的対照の値 (0.063 μA cm-2) よりも 1 桁高く、これは Rct と一致しています。 EISで測定した値です。最初の数日間、緑膿菌ブロス内のインピーダンス値は、緑膿菌細胞の付着とバイオフィルムの形成により増加しました。ただし、バイオフィルムがサンプル表面を完全に覆うと、インピーダンスは低下します。保護層は、主にバイオフィルムおよびバイオフィルム代謝物の形成により攻撃されます。そのため、時間の経過とともに耐食性が低下し、緑膿菌の堆積により局所的な腐食が発生します。非生物的環境における傾向は異なります。非生物学的対照の耐食性は、緑膿菌ブロスに曝露されたサンプルの対応する値よりもはるかに高かった。さらに、非生物サンプルの場合、Rct 2707 HDSS 値は 14 日目に 489 kΩ cm2 に達しました。これは、緑膿菌の存在下 (32 kΩ cm2) よりも 15 倍高くなります。したがって、2707 HDSS は無菌環境において優れた耐食性を備えていますが、緑膿菌バイオフィルムによる MIC 攻撃からは保護されません。
これらの結果は、図２および図３の分極曲線からも観察することができる。2b.陽極分岐は、緑膿菌バイオフィルム形成および金属酸化反応に関連しています。同時に、陰極反応は酸素の還元です。緑膿菌の存在により腐食電流密度が大幅に増加し、非生物対照よりも約 1 桁高かった。これは、緑膿菌バイオフィルムが 2707 HDSS の局所的な腐食を促進することを示しました。Yuan ら 29 は、70/30 Cu-Ni 合金の腐食電流密度が緑膿菌バイオフィルムによって増加することを発見しました。これは、緑膿菌バイオフィルムによる酸素還元の生体触媒作用によるものと考えられます。この観察は、この研究における MIC 2707 HDSS も説明できるかもしれません。好気性バイオフィルムは、その下の酸素含有量を減少させることもあります。したがって、酸素による金属表面の再不動態化の拒否が、この研究における MIC に寄与する要因である可能性があります。
ディキンソンら。38 は、化学反応および電気化学反応の速度は、サンプル表面に付着した細菌の代謝活動と腐食生成物の性質に直接依存することを示唆しました。図 5 および表 5 に示すように、14 日後には細胞数とバイオフィルムの厚さが減少しました。これは、14 日後、2216E 培地の栄養枯渇または 2707 HDSS マトリックスからの有毒金属イオンの放出により、2707 HDSS 表面上のアンカー細胞のほとんどが死滅したという事実によって合理的に説明できます。これはバッチ実験の制限です。
この研究では、緑膿菌バイオフィルムが 2707 HDSS 表面のバイオフィルムの下の Cr と Fe の局所的な枯渇を促進しました (図 6)。表 6 では、サンプル D ではサンプル C と比較して Fe および Cr が減少しており、緑膿菌バイオフィルムによって引き起こされた Fe および Cr の溶解が最初の 7 日後も維持されていることを示しています。2216E 環境は、海洋環境をシミュレートするために使用されます。17700 ppm の Cl- が含まれており、これは天然海水の含有量に匹敵します。17700 ppm の Cl- の存在が、XPS で分析した 7 日間および 14 日間の非生物学的サンプルにおける Cr の減少の主な理由でした。緑膿菌の試験サンプルと比較して、非生物環境における塩素に対する 2707 HDSS の強い耐性により、非生物試験サンプル中の Cr の溶解ははるかに少なくなっています。図上。図９は、不動態化膜中のＣｒ６＋の存在を示している。これは、Chen と Clayton によって示唆されているように、緑膿菌バイオフィルムによる鋼表面からの Cr の除去に関連している可能性があります 39。
細菌の増殖により、培養前後の培地のpH値はそれぞれ7.4と8.2でした。したがって、バルク培地中の pH が比較的高いため、緑膿菌バイオフィルムの下では有機酸の腐食がこの研究に寄与する可能性は低いです。非生物学的対照培地の pH は、14 日間の試験期間中に有意な変化はありませんでした (最初の 7.4 から最後の 7.5 まで)。インキュベーション後の接種培地の pH の上昇は緑膿菌の代謝活性に関連しており、テストストリップの非存在下でも pH に対する同じ影響が見られました。
図に示すように。図７に示されるように、緑膿菌バイオフィルムによって生じた最大ピット深さは０．６９μｍであり、これは非生物培地（０．０２μｍ）よりも著しく大きい。これは上記の電気化学データと一致します。同じ条件下では、ピット深さ 0.69 μm は、2205 DSS40 に指定されている値 9.5 μm の 10 分の 1 以上小さいです。これらのデータは、2707 HDSS が 2205 DSS よりも MIC に対して優れた耐性を示すことを示しています。2707 HDSS は Cr レベルが高いため、より長い不動態化が可能になり、緑膿菌の脱不動態化がより困難になり、有害な二次析出孔食なしでプロセスを開始できるため、これは驚くべきことではありません 41。
結論として、緑膿菌培養液中の 2707 HDSS 表面では MIC の孔食が見つかりましたが、非生物培地では孔食は無視できました。この研究は、2707 HDSS が 2205 DSS よりも MIC に対する耐性が優れていることを示していますが、緑膿菌バイオフィルムのため、MIC に対して完全に免疫があるわけではありません。これらの結果は、海洋環境に適したステンレス鋼と平均寿命の選択に役立ちます。
2707 個の HDSS サンプルは、中国の瀋陽にあるノースイースタン大学 (NEU) 冶金学部から提供されました。2707 HDSS の元素組成を表 1 に示します。これは、ノースイースタン大学の材料分析試験部門によって分析されました。すべてのサンプルは 1180°C で 1 時間固溶化処理されました。腐食試験の前に、露出表面積 1 cm2 の 2707 HDSS コイン鋼を炭化ケイ素サンドペーパーで 2000 グリットまで研磨し、その後 0.05 μm の Al2O3 粉末スラリーでさらに研磨しました。側面と底面は不活性塗料で保護されています。乾燥後、サンプルを滅菌脱イオン水で洗浄し、75% (v/v) エタノールで 0.5 時間滅菌しました。次に、使用前に紫外線 (UV) 光の下で 0.5 時間風乾させました。
海洋菌株緑膿菌 MCCC 1A00099 は、中国のアモイ海洋培養コレクション (MCCC) から購入しました。Marine 2216E 液体培地 (Qingdao Hope Biotechnology Co., Ltd.、青島、中国) を使用して、250 ml フラスコおよび 500 ml 電気化学ガラスセル内で緑膿菌を 37°C の好気条件下で培養しました。培地含有量 (g/l): 19.45 NaCl、5.98 MgCl2、3.24 Na2SO4、1.8 CaCl2、0.55 KCl、0.16 Na2CO3、0.08 KBr、0.034 SrCl2、0.08 SrBr2、0.022 H3BO3、0.004 NaSiO3、0.008、 0.008 Na4F0H20PO。酵母エキス1.0、クエン酸鉄0.1。接種前に 121 °C で 20 分間オートクレーブします。固着細胞と浮遊細胞は、血球計数器を使用して倍率 400 倍の光学顕微鏡下で計数されました。接種直後の浮遊性緑膿菌細胞の初期濃度は約 106 細胞/mL でした。
電気化学試験は、培地容量が 500 ml の古典的な 3 電極ガラスセルで実行されました。白金シートと飽和カロメル電極 (SCE) を塩橋で満たしたルギン毛細管を介して反応器に接続し、それぞれ対電極と参照電極として機能させました。作用電極を作成するには、ゴムでコーティングされた銅線を各サンプルに取り付け、エポキシでコーティングし、作用電極用に片面に約 1 cm2 の表面積を残しました。電気化学的測定中、サンプルは 2216E 培地に置かれ、ウォーターバス内で一定のインキュベーション温度 (37°C) に保たれました。OCP、LPR、EIS、および潜在的な動的分極データは、Autolab ポテンショスタット (Reference 600TM、Gamry Instruments, Inc.、米国) を使用して測定されました。LPR テストは、-5 および 5 mV 範囲の 0.125 mV s-1 のスキャン レートおよび 1 Hz のサンプリング レートの Eocp で記録されました。EIS は、0.01 ～ 10,000 Hz の周波数範囲にわたる正弦波で 5 mV の印加電圧を使用して、定常状態 Eocp で実行されました。電位掃引の前に、安定した自由腐食電位が 42 に達するまで、電極は開回路モードでした。と。各試験を緑膿菌の有無にかかわらず 3 回繰り返しました。
金属組織学的分析用のサンプルは、2000 グリットの湿った SiC ペーパーで機械的に研磨され、次に光学観察のために 0.05 μm の Al2O3 粉末スラリーで研磨されました。金属組織学的分析は、光学顕微鏡を使用して実行されました。サンプルは 10 wt% 水酸化カリウム溶液でエッチングされました 43。
インキュベーション後、リン酸緩衝食塩水 (PBS) (pH 7.4 ± 0.2) で 3 回洗浄し、2.5% (v/v) グルタルアルデヒドで 10 時間固定してバイオフィルムを固定します。続いて、空気乾燥する前に、段階的にエタノール（50%、60%、70%、80%、90%、95%、100体積%）で脱水します。最後に、SEM44 観察用に導電性を与えるために、金膜をサンプルの表面にスパッタリングしました。SEM 画像は、各サンプルの表面上で最も確立された緑膿菌細胞のある位置に焦点を当てています。化学元素を検出するためにEMF分析が実行されました。ピットの深さを測定するために、Zeiss 共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM) (LSM 710、Zeiss、ドイツ) を使用しました。バイオフィルムの下の腐食ピットを観察するために、まず中国国家標準 (CNS) GB/T4334.4-2000 に従ってテストサンプルを洗浄し、テストサンプルの表面から腐食生成物とバイオフィルムを除去しました。
広範囲の結合エネルギーにおける単色 X 線源 (エネルギー 1500 eV、出力 150 W の Al Kα 線) を使用した X 線光電子分光法 (XPS、ESCALAB250 表面分析システム、Thermo VG、米国) 分析標準条件の –1350 eV を下回る 0。50 eV のパス エネルギーと 0.2 eV ステップ サイズを使用して高分解能スペクトルを記録します。
インキュベートしたサンプルを取り出し、PBS (pH 7.4 ± 0.2) で 15 秒間穏やかに洗浄します。サンプル上のバイオフィルムの細菌生存率を観察するために、LIVE/DEAD BacLight 細菌生存率キット (Invitrogen、ユージーン、オレゴン州、米国) を使用してバイオフィルムを染色しました。このキットには、SYTO-9 緑色蛍光色素とヨウ化プロピジウム (PI) 赤色蛍光色素の 2 つの蛍光色素が含まれています。CLSM では、蛍光緑色と赤色の点がそれぞれ生細胞と死細胞を表します。染色するには、SYTO-9 3 μl と PI 溶液 3 μl を含む混合物 1 ml を室温（23℃）、暗所で 20 分間インキュベートします。その後、ニコン CLSM 装置 (C2 Plus、ニコン、日本) を使用して、染色されたサンプルを 2 つの波長 (生細胞の場合は 488 nm、死細胞の場合は 559 nm) で観察しました。3Dスキャンモードでバイオフィルムの厚さを測定します。
この記事を引用する方法: Li, H. et al.2707超二相ステンレス鋼の微生物腐食に対する緑膿菌海洋バイオフィルムの影響。科学。ハウス6、20190;土井:10.1038/srep20190 (2016)。
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