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超小型 (54 × 58 × 8.5 mm) で広口径 (1 × 7 mm) の 9 色分光計が開発され、10 枚のダイクロイック ミラーのアレイによって「2 つに分割」され、瞬間的なスペクトル イメージングに使用されました。開口サイズよりも小さな断面を持つ入射光束は、幅20 nmの連続したストリップと、中心波長530、550、570、590、610、630、650、670、690 nmの9つの色光束に分割されます。9 つのカラー ストリームの画像がイメージ センサーによって同時に効率的に測定されます。開発したダイクロイックミラーアレイは、従来のダイクロイックミラーアレイとは異なり、独自の2枚構成により、同時に測定できる色数が増加するだけでなく、各色ストリームの画像解像度も向上します。開発された9色分光計は4キャピラリー電気泳動に使用されます。9 色のレーザー誘起蛍光を使用して、各キャピラリー内で同時に移動する 8 つの色素の同時定量分析。9色分光器は超小型で安価であるだけでなく、高い光束とほとんどの分光イメージング用途に十分な分光分解能を備えているため、さまざまな分野で広く使用できます。
ハイパースペクトルおよびマルチスペクトル イメージングは、天文学 2、地球観察のためのリモート センシング 3,4、食料と水の品質管理 5,6、美術品の保存と考古学 7、法医学 8、外科 9、生物医学の分析と診断 10,11 などの重要な部分となっています。 分野 1 不可欠な技術、12、13。視野内の各発光点から発せられる光のスペクトルを測定する方法は、(1) 点走査 (「ほうき」)14,15、(2) 線形走査 (「穂」)16,17,18 に分けられます。 、（3）長さは波19、20、21をスキャンし、（4）画像22、23、24、25。これらすべての方法の場合、空間解像度、スペクトル解像度、時間解像度はトレードオフの関係にあります9、10、12、26。さらに、光出力は感度、つまりスペクトルイメージングにおける信号対雑音比に大きな影響を与えます26。光束、すなわち光の利用効率は、測定された波長域の総光量に対する各発光点の単位時間当たりの実測光量の比に正比例する。(4)は、すべての発光点から発せられる光のスペクトルを同時に測定するため、各発光点から発せられる光の強度やスペクトルが時間とともに変化する場合や、各発光点の位置が時間とともに変化する場合に適した方法である。24.
上記の方法のほとんどは、クラス (1)、(2)、(4) の 18 個の格子または 14、16、22、23 個のプリズム、または 20、21 個のフィルター ディスク、液体フィルターを使用する、大型、複雑、および/または高価な分光計と組み合わせられます。 。カテゴリ (3) の結晶同調可能フィルタ (LCTF)25 または音響光学同調可能フィルタ (AOTF)19。対照的に、カテゴリ (4) のマルチミラー分光計は、構成が単純なため小型で安価です27、28、29、30。また、各ダイクロイックミラーが共有する光（つまり、各ダイクロイックミラーへの入射光の透過光と反射光）を余すことなく利用し続けるため、光束が高い。ただし、同時に測定する必要がある波長帯域（つまり色）の数は 4 つ程度に制限されます。
蛍光検出に基づくスペクトルイメージングは、生物医学の検出および診断における多重分析に一般的に使用されます 10、13 。多重化では、複数の分析物（特定の DNA やタンパク質など）が異なる蛍光色素で標識されるため、視野内の各発光点に存在する各分析物が多成分分析を使用して定量化されます。32 は、各発光点から発せられた検出された蛍光スペクトルを分解します。このプロセス中、それぞれが異なる蛍光を発する異なる色素が共局在する、つまり空間と時間の中で共存することができます。現在、単一のレーザー ビームで励起できる色素の最大数は 833 です。この上限は、スペクトル分解能 (つまり、色の数) によって決まりますが、FRET (FRET を使用) での蛍光スペクトルの幅 (≧50 nm) と色素のストークスシフト量 (≦200 nm) によって決まります10。 。ただし、混合染料のスペクトルの重複を排除するには、色の数が染料の数以上である必要があります31、32。したがって、同時測定色数を８色以上に増やす必要がある。
最近、超小型の七色性分光計（七色性ミラーのアレイとイメージセンサーを使用して 4 つの蛍光束を測定する）が開発されました。この分光計は、回折格子やプリズムを使用した従来の分光計よりも 2 ～ 3 桁小型です 34、35。しかし、分光計に 7 枚を超えるダイクロイック ミラーを配置し、同時に 7 色を超える色を測定することは困難です 36,37。ダイクロイックミラーの枚数が増えると、ダイクロイック光束の光路長の最大差が大きくなり、全ての光束を一つの感覚面上に表示することが困難になる。光束の最長光路長も増加するため、分光計の開口幅 (つまり、分光計によって分析される光の最大幅) が減少します。
上記の問題に応えて、2層の「ダイクロイック」デカクロマティックミラーアレイと瞬間的な分光イメージング用のイメージセンサーを備えた超小型9色分光計[カテゴリ(4)]を開発しました。開発した分光器は従来の分光器と比較して、最大光路長の差が小さく、最大光路長が小さくなりました。この技術は、4 キャピラリー電気泳動に適用され、レーザー誘起の 9 色の蛍光を検出し、各キャピラリー内の 8 つの色素の同時移動を定量化しています。開発した分光器は、超小型かつ安価であるだけでなく、高い光束とほとんどの分光イメージング用途に十分な分光分解能を備えているため、さまざまな分野で広く使用することができます。
従来の 9 色分光計を図に示します。1a.従来の超小型7色分光器31の設計を踏襲しており、9枚のダイクロイックミラーを右45度の角度で水平に配置し、9枚のダイクロイックミラーの上方にイメージセンサー(S)を配置しています。下（C0）から入射する光は、9 枚のダイクロイック ミラーのアレイによって上向きの 9 つの光流（C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9）に分割されます。9 つのカラー ストリームすべてがイメージ センサーに直接供給され、同時に検出されます。この研究では、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、および C9 は波長順に、マゼンタ、バイオレット、ブルー、シアン、グリーン、イエロー、オレンジ、レッドオレンジ、およびそれぞれ赤。図 3 に示すように、本書ではこれらの色の指定が使用されていますが、人間の目で見える実際の色とは異なるためです。
従来型と新型の9色分光器の概略図。(a) 9 つのダイクロイック ミラーのアレイを備えた従来の 9 色分光計。(b) 2 層ダイクロイック ミラー アレイを備えた新しい 9 色分光計。入射光束C0は9つの色光束C1〜C9に分割され、イメージセンサーSで検出されます。
開発された新しい9色分光計は、図1bに示すように、2層のダイクロイックミラー格子とイメージセンサーを備えています。下の段では、5 つのダイクロイック ミラーが右に 45° 傾けられ、デカマーのアレイの中心から右に並んでいます。最上レベルでは、追加の 5 つのダイクロイック ミラーが左に 45° 傾けられ、中央から左に配置されています。下層の一番左のダイクロイックミラーと上層の一番右のダイクロイックミラーが重なっています。入射光束（C0）は、右側の5枚のダイクロイックミラーにより下から4つの出射色束（C1～C4）に分割され、左側の5枚のダイクロイックミラーにより5つの出射色光束（C5～C4）に分割される（C9）。従来の 9 色分光計と同様に、9 色すべてのストリームがイメージ センサー (S) に直接注入され、同時に検出されます。図 1a と 1b を比較すると、新しい 9 色分光計の場合、9 つの色光束の最大差と最長光路長の両方が半分になっていることがわかります。
29mm（幅）×31mm（奥行き）×6mm（高さ）の超小型2層ダイクロイックミラーアレイの詳細な構成を図2に示します。10進ダイクロイックミラーアレイは右側の5枚のダイクロイックミラーで構成されています。 (M1 ～ M5) と左側の 5 つのダイクロイック ミラー (M6 ～ M9 およびもう 1 つの M5)、各ダイクロイック ミラーは上部のアルミニウム ブラケットに固定されています。すべてのダイクロイック ミラーは、ミラーを通る流れの屈折による平行移動を補償するために互い違いに配置されています。M1 の下にはバンドパス フィルター (BP) が固定されています。M1、BPの寸法は10mm(長辺)×1.9mm(短辺)×0.5mm(厚さ)です。残りのダイクロイックミラーの寸法は 15 mm × 1.9 mm × 0.5 mm です。M1 と M2 の間のマトリックス ピッチは 1.7 mm ですが、他のダイクロイック ミラーのマトリックス ピッチは 1.6 mm です。図上。図２ｃは、入射光束Ｃ０と９つの色光束Ｃ１〜Ｃ９を結合し、ミラーのディチャンバーマトリックスによって分離されている。
2層ダイクロイックミラーマトリクスの構築。２層ダイクロイックミラーアレイ（寸法２９ｍｍ×３１ｍｍ×６ｍｍ）の（ａ）斜視図、（ｂ）断面図。下層に位置する 5 枚のダイクロイック ミラー (M1 ～ M5)、上層に位置する 5 枚のダイクロイック ミラー (M6 ～ M9 ともう 1 つの M5)、および M1 の下に位置するバンドパス フィルター (BP) で構成されます。(c) C0 と C1 ～ C9 が重なった垂直方向の断面図。
図 2 の c の幅 C0 で示される水平方向の開口の幅は 1 mm、図 2 の c の面に垂直な方向の幅は、アルミニウム ブラケットの設計によって与えられます。 – 7 mm。つまり、新しい9色分光器は1mm×7mmという大きな口径サイズを持っています。C4の光路長はC1～C9の中で最も長く、上記の超小型サイズ（29mm×31mm×6mm）によりダイクロイックミラーアレイ内のC4の光路長は12mmとなります。また、C1～C9の中でC5の光路長が最も短く、C5の光路長は5.7mmとなっている。したがって、光路長の差は最大で6.3mmとなります。上記光路長は、M1～M9、BP（石英製）の光伝送用光路長で補正したものです。
М1−М9 および VR のスペクトル特性は、光束 С1、С2、С3、С4、С5、С6、С7、С8、С9 が波長範囲 520 ～ 540、540 ～ 560、560 ～ 580、580 になるように計算されます。それぞれ –600 、600 ～ 620、620 ～ 640、640 ～ 660、660 ～ 680、および 680 ～ 700 nm。
製造されたデカクロマティックミラーのマトリックスの写真を図3aに示します。M1 ～ M9 と BP は、それぞれアルミニウム サポートの 45 度の傾斜面と水平面に接着されていますが、M1 と BP は図の裏側に隠れています。
デカンミラーアレイの製作とデモンストレーション。(a) 作製したデカクロマートミラーのアレイ。(b) 1 mm × 7 mm の 9 色のスプリット イメージ。デカクロマティック ミラーのアレイの前に置かれ、白色光でバックライトされた紙に投影されます。(c) 背後から白色光で照らされた減色ミラーのアレイ。(d) デカンミラーアレイから発せられる 9 色の分裂流。c のデカンミラーアレイの前に煙を満たしたアクリル容器を置き、部屋を暗くすることで観察。
４５°の入射角で測定されたＭ１～Ｍ９ Ｃ０の透過スペクトル、および０°の入射角で測定されたＢＰ Ｃ０の透過スペクトルを図２および図３に示す。4a.C0 に対する C1 ～ C9 の透過スペクトルを図 1 と 2 に示します。4b.これらのスペクトルは、図1および2のスペクトルから計算されました。これは、図４ａの光路Ｃ１〜Ｃ９に従って図４ａに示されている。1bと2c。たとえば、TS(C4) = TS (BP) × [1 − TS (M1)] × TS (M2) × TS (M3) × TS (M4) × [1 − TS (M5)]、TS(C9 ) = TS (BP) × TS (M1) × [1 − TS (M6)] × TS (M7) × TS (M8) × TS (M9) × [1 − TS (M5)]、ここで TS(X) および[ 1 − TS(X)] は、それぞれ X の透過スペクトルと反射スペクトルです。図 4b に示すように、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、および C9 の帯域幅 (帯域幅 ≥50%) は、521 ～ 540、541 ～ 562、563 ～ 580、581 ～ 602、603 です。 -623、624-641、642-657、659-680、および682-699nm。これらの結果は、開発された範囲と一致しています。また、C0光の利用効率が高く、C1〜C9の平均最大光透過率は92%である。
ダイクロイックミラーと分割された9色光束の透過スペクトル。(a) 45°入射での M1 ～ M9 と 0° 入射での BP の測定された透過スペクトル。(b) (a) から計算された C0 に対する C1 ～ C9 の透過スペクトル。
図上。図３ｃでは、ダイクロイックミラーのアレイが垂直に配置されているため、図３ａの右側が上側となり、コリメートＬＥＤ（Ｃ０）の白色ビームがバックライトされる。図 3a に示すデカクロマティック ミラーのアレイは、54 mm (高さ) × 58 mm (奥行き) × 8.5 mm (厚さ) のアダプタに取り付けられています。図上。図３ｄに示す状態に加えて、3cでは、室内の照明を消し、煙で満たされたアクリルタンクを退色鏡のアレイの前に置きました。その結果、デカトロイック ミラーのアレイから発する 9 つの二色性の流れがタンク内に表示されます。それぞれの分割ストリームは、寸法 1 × 7 mm の長方形の断面を持ち、これは新しい 9 色分光計の開口サイズに対応します。図 3b では、図 3c のダイクロイック ミラーのアレイの前に紙が置かれ、紙上に投影された 9 つのダイクロイック ストリームの 1 x 7 mm の画像が紙の移動方向から観察されます。ストリーム。図の 9 つの色分解ストリーム。3b および d は、上から下に C4、C3、C2、C1、C5、C6、C7、C8、および C9 であり、これは図 1 および 2 にも見られます。1b および 2c。それらは、その波長に対応する色で観察されます。LED の白色光強度が低いため (補足図 S3 を参照)、図の C9 (682 ～ 699 nm) をキャプチャするために使用されるカラー カメラの感度が原因です。他の分割フローは弱いです。同様に、C9 も肉眼ではかすかに見えました。一方、C2 (上から 2 番目のストリーム) は図 3 では緑色に見えますが、肉眼ではもっと黄色に見えます。
図 3c から d への移行は、補足ビデオ 1 に示されています。LED からの白色光がデカクロマティック ミラー アレイを通過した直後、光は 9 つのカラー ストリームに同時に分割されます。最終的には、桶の中の煙が上から下に向かって徐々に消えていき、９色の粉も上から下に消えていきました。対照的に、補足ビデオ 2 では、デカクロマティック ミラーのアレイに入射する光束の波長を 690、671、650、632、610、589、568、550、532 nm の順に長波長から短波長に変化させた場合、 。, C9、C8、C7、C6、C5、C4、C3、C2、C1の順に9つの分割ストリームのうち、対応する分割ストリームのみが表示されます。アクリル製のリザーバーが石英製のプールに置き換えられており、各分流のフレークが斜め上方向からはっきりと観察できます。また、副映像３は、副映像２の波長変更部分が再生されるように編集されている。これは、減色ミラーアレイの特性を最も雄弁に表現したものです。
上記の結果は、製造されたデカクロマティック ミラー アレイまたは新しい 9 色分光計が意図したとおりに動作することを示しています。新しい 9 色分光計は、アダプターを備えたデカクロマート ミラーのアレイをイメージ センサー ボードに直接取り付けることによって形成されます。
図2cの紙面垂直方向に1mm間隔で配置されたφ50μmの4つの放射点から放射される波長範囲400～750nmの光束、それぞれ研究31、研究34。焦点距離1.4mm、ピッチ1mmのφ1mmレンズ4枚。4 つのコリメートされたストリーム (4 つの C0) が、1 mm 間隔で新しい 9 色分光計の DP に入射します。ダイクロイック ミラーのアレイは、各ストリーム (C0) を 9 つのカラー ストリーム (C1 ～ C9) に分割します。結果として得られる 36 ストリーム (C1 ～ C9 の 4 セット) は、ダイクロイック ミラーのアレイに直接接続された CMOS (S) イメージ センサーに直接注入されます。その結果、図5aに示すように、最大光路差が小さく最大光路が短いため、36ストリームすべての画像が同時に鮮明に同じサイズで検出されました。下流のスペクトル (補足図 S4 を参照) によると、4 つのグループ C1、C2、および C3 の画像強度は比較的低いです。36 枚の画像のサイズは 0.57 ± 0.05 mm (平均 ± SD) でした。したがって、像倍率は平均１１．４倍となる。画像間の垂直方向の間隔は平均 1 mm (レンズ アレイと同じ間隔)、水平方向の間隔は平均 1.6 mm (ダイクロイック ミラー アレイと同じ間隔) です。画像サイズは画像間の距離よりもはるかに小さいため、各画像を独立して（低クロストークで）測定できます。一方、私たちの以前の研究で使用された従来の7色分光計によって記録された28ストリームの画像が図5Bに示されています。7つのダイクロイックミラーのアレイは、9つのダイクロイックミラーのアレイから右端の2つのダイクロイックミラーを削除することによって作成されました。図 1a のミラー。すべての画像が鮮明であるわけではなく、画像サイズは C1 から C7 に増加します。28 枚の画像のサイズは 0.70 ± 0.19 mm です。したがって、すべての画像において高い画像解像度を維持することは困難です。図 5b の画像サイズ 28 の変動係数 (CV) は 28% でしたが、図 5a の画像サイズ 36 の変動係数 (CV) は 9% に減少しました。上記の結果は、新しい 9 色分光器が同時に測定する色の数を 7 色から 9 色に増やしただけでなく、各色の画像解像度も高いことを示しています。
従来型分光器と新型分光器で形成されるスプリットイメージの品質の比較。(a) 新しい 9 色分光計によって生成された 4 つのグループの 9 色分解画像 (C1 ～ C9)。(b) 従来の 7 色分光計で形成された 4 セットの 7 色分解画像 (C1 ～ C7)。4 つの発光点からの波長 400 ～ 750 nm の光束 (C0) がコリメートされて各分光器に入射します。
9 色分光計のスペクトル特性が実験的に評価され、その評価結果が図 6 に示されています。図 6a は図 5a と同じ結果を示していることに注意してください。つまり、4 C0 400 ～ 750 nm の波長で、36 枚の画像すべてが検出されています。 (4 グループ C1 ～ C9)。逆に、図6b–jに示すように、各C0が530、550、570、590、610、630、650、670、または690 nmの特定の波長を持つ場合、対応する画像はほぼ4つだけです（4つ）。グループは C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8 または C9 を検出しました）。ただし、4つの対応する画像に隣接する画像の一部は、図4bに示すC1〜C9の透過スペクトルがわずかに重なり、各C0が方法で説明したように特定の波長で10 nmのバンドを持っているため、非常に弱く検出されます。これらの結果は、図１および２に示されるＣ１〜Ｃ９透過スペクトルと一致する。つまり、9 色分光計は、図 4b に示す結果に基づいて予想どおりに動作します。4b.したがって、像強度分布 C1 ～ C9 は各 C0 のスペクトルであると結論付けられます。
9 色分光計の分光特性。新しい 9 色分光計は、入射光 (4 つの C0) の波長が (a) 400 ～ 750 nm (図 5a に示すように)、(b) の場合に、4 セットの 9 色に分解された画像 (C1 ～ C9) を生成します。 530nm。nm、(c) 550 nm、(d) 570 nm、(e) 590 nm、(f) 610 nm、(g) 630 nm、(h) 650 nm、(i) 670 nm、(j) 690 nm、それぞれ。
開発された 9 色分光計は、4 キャピラリー電気泳動に使用されました (詳細については、補足資料を参照) 31、34、35。4キャピラリーマトリックスは、レーザー照射部位に1mm間隔で配置された4本のキャピラリー（外径360μm、内径50μm）から構成されています。8 つの色素、つまり FL-6C (色素 1)、JOE-6C (色素 2)、dR6G (色素 3)、TMR-6C (色素 4)、CXR-6C (色素 5)、TOM- で標識された DNA 断片を含むサンプル蛍光波長の短い順に６Ｃ（色素６）、ＬＩＺ（色素７）、ＷＥＮ（色素８）を４本のキャピラリー（以下、Ｃａｐ１、Ｃａｐ２、Ｃａｐ３、Ｃａｐ４と呼ぶ）に分けて配置する。Cap1 ～ Cap4 からのレーザー誘起蛍光は、4 つのレンズのアレイでコリメートされ、同時に 9 色分光計で記録されました。電気泳動中の9色（C1〜C9）蛍光の強度ダイナミクス、つまり各キャピラリーの9色電気泳動図を図7aに示します。Cap1 ～ Cap4 では、同等の 9 色の電気泳動図が得られます。図 7a の Cap1 矢印で示されているように、各 9 色の電気泳動図の 8 つのピークは、それぞれ Dye1 ～ Dye8 からの 1 つの蛍光発光を示しています。
9 色 4 キャピラリー電気泳動分光計を使用した 8 つの色素の同時定量。(a) 各キャピラリーの 9 色 (C1 ～ C9) 電気泳動図。矢印 Cap1 で示される 8 つのピークは、8 つの色素 (Dye1 ～ Dye8) の個々の蛍光発光を示します。矢印の色は(b)と(c)の色に対応しています。(b) キャピラリーあたり 8 つの色素 (Dye1 ～ Dye8) の蛍光スペクトル。c キャピラリーあたり 8 つの色素 (Dye1 ～ Dye8) の電気泳動図。Dye7 標識 DNA 断片のピークを矢印で示し、Cap4 の塩基長を示します。
8 つのピークにおける C1 ～ C9 の強度分布を図 1 と 2 に示します。それぞれ7b。C1〜C9とDye1〜Dye8は両方とも波長順であるため、図7bの8つの分布は、Dye1〜Dye8の蛍光スペクトルを左から右に順番に示しています。この研究では、Dye1、Dye2、Dye3、Dye4、Dye5、Dye6、Dye7、Dye8 はそれぞれマゼンタ、バイオレット、ブルー、シアン、グリーン、イエロー、オレンジ、レッドで表示されます。図７ａの矢印の色は、図７ｂの染料の色に対応していることに留意されたい。図 7b の各スペクトルの C1 ～ C9 蛍光強度は、それらの合計が 1 に等しくなるように正規化されました。8 つの同等の蛍光スペクトルが Cap1 ～ Cap4 から得られました。色素 1 ～色素 8 の間の蛍光のスペクトルの重複を明確に観察できます。
図 7c に示すように、各キャピラリーについて、図 7a の 9 色の電気泳動グラムは、図 7b の 8 つの蛍光スペクトルに基づく多成分分析によって 8 色素電気泳動グラムに変換されました (詳細は補足資料を参照)。図 7a の蛍光のスペクトルの重複は図 7c には表示されていないため、異なる量の Dye1 ～ Dye8 が同時に蛍光を発する場合でも、Dye1 ～ Dye8 は各時点で個別に同定および定量できます。これは、従来の 7 色検出31 では実行できませんが、開発された 9 色検出では実現できます。図7cの矢印Cap1で示すように、蛍光発光一重項Dye3（青）、Dye8（赤）、Dye5（緑）、Dye4（シアン）、Dye2（紫）、Dye1（マゼンタ）、およびDye6（黄）のみが存在します。 ) は、予想される時系列順に観察されます。色素 7 (オレンジ) の蛍光発光では、オレンジの矢印で示された単一ピークに加えて、他のいくつかの単一ピークが観察されました。この結果は、サンプルにサイズ標準である、異なる塩基長の Dye7 標識 DNA フラグメントが含まれているという事実によるものです。図 7c に示すように、Cap4 の場合、これらの塩基長は 20、40、60、80、100、114、120、140、160、180、200、214、および 220 塩基長です。
2層ダイクロイックミラーをマトリクス状に配置して開発した9色分光器は、小型かつシンプルなデザインが特長です。図に示すアダプター内のデカクロマティックミラーの配列は次のとおりです。イメージセンサーボードに直接取り付けられた3c（図S1およびS2を参照）、9色分光計はアダプターと同じ寸法、つまり54×58×8.5 mmを持ちます。(厚さ) 。この超小型サイズは、回折格子やプリズムを使用する従来の分光計よりも 2 ～ 3 桁小さいです。さらに、9 色分光計はイメージ センサーの表面に光が垂直に入射するように構成されているため、顕微鏡、フローサイトメーター、分析装置などのシステム内で 9 色分光計用のスペースを簡単に割り当てることができます。システムのさらなる小型化を実現するキャピラリーグレーティング電気泳動アナライザー。同時に、9色分光計に使用される10枚のダイクロイックミラーとバンドパスフィルターのサイズは、わずか10×1.9×0.5 mmまたは15×1.9×0.5 mmです。したがって、１００個を超えるこのような小さなダイクロイックミラーおよびバンドパスフィルタを、それぞれダイクロイックミラーおよび６０ｍｍ ２ バンドパスフィルタから切り出すことができる。したがって、デカクロマートミラーのアレイを低コストで製造することができる。
9色分光器のもう一つの特徴は、優れた分光特性です。特に、スナップショットのスペクトル画像の取得、つまりスペクトル情報を含む画像の同時取得が可能になります。各画像について、520 ～ 700 nm の波長範囲と 20 nm の解像度で連続スペクトルが得られました。言い換えると、各画像に対して 9 つの色の光の強度、つまり 520 ～ 700 nm の波長範囲を均等に分割する 9 つの 20 nm バンドが検出されます。ダイクロイックミラーとバンドパスフィルターの分光特性を変更することで、9バンドの波長範囲と各バンドの幅を調整できます。9 色検出は、スペクトル イメージングによる蛍光測定 (このレポートで説明されているとおり) だけでなく、スペクトル イメージングを使用する他の多くの一般的なアプリケーションにも使用できます。ハイパースペクトルイメージングは何百もの色を検出できますが、検出可能な色の数が大幅に減少したとしても、視野内の複数の物体を多くの用途で十分な精度で識別できることがわかっています38、39、40。スペクトル イメージングでは空間解像度、スペクトル解像度、時間解像度はトレードオフの関係にあるため、色数を減らすと空間解像度と時間解像度を向上させることができます。また、この研究で開発されたもののような単純な分光計を使用し、計算量をさらに削減することもできます。
この研究では、9 色の検出に基づいて重複する蛍光スペクトルをスペクトル分離することにより、8 つの色素を同時に定量しました。時間的および空間的に共存する最大 9 つの色素を同時に定量できます。9 色分光計の特別な利点は、高光束と大きな口径 (1 × 7 mm) です。デカン ミラー アレイは、9 つの波長範囲のそれぞれにおいて、開口部からの光の 92% の最大透過率を持っています。520～700nmの波長範囲の入射光の利用効率はほぼ100%です。これほど広範囲の波長において、これほど高い使用効率を実現できる回折格子はありません。回折格子の回折効率がある波長で 90% を超えたとしても、その波長と特定の波長の差が大きくなるにつれて、別の波長での回折効率は低下します41。図2cの面方向に垂直な開口幅は、この研究で使用したイメージセンサーの場合のように、デカマーアレイをわずかに変更することで7 mmからイメージセンサーの幅まで拡張できます。
9 色分光計は、この研究で示されているようにキャピラリー電気泳動だけでなく、他のさまざまな目的にも使用できます。たとえば、下図に示すように、9 色分光計を蛍光顕微鏡に応用できます。サンプルの平面は、10 倍の対物レンズを通して 9 色分光計のイメージ センサー上に表示されます。対物レンズとイメージセンサー間の光学距離は200mmですが、9色分光器の入射面とイメージセンサー間の光学距離はわずか12mmです。したがって、画像は入射面の開口部（1 × 7 mm）のサイズにほぼカットされ、9 つのカラー画像に分割されます。つまり、サンプル面内の 0.1 × 0.7 mm の領域で 9 色のスナップショットのスペクトル画像を撮影できます。さらに、図2cの水平方向に対物レンズに対してサンプルを走査することにより、サンプル面上のより広い領域の9色のスペクトル画像を取得することが可能です。
デカクロマティック ミラー アレイ コンポーネント、つまり M1 ～ M9 および BP は、標準的な沈殿法を使用して Asahi Spectra Co., Ltd. によって特注で製造されました。多層誘電体材料は、サイズ 60 × 60 mm、厚さ 0.5 mm の 10 枚の石英プレートに個別に塗布され、次の要件を満たしました: M1: IA = 45°、520 ～ 590 nm で R ≧ 90%、610 ～ 590 nm で Tave ≧ 90% 610nm。700 nm、M2: IA = 45°、520 ～ 530 nm で R ≧ 90%、550 ～ 600 nm で Tave ≧ 90%、M3: IA = 45°、540 ～ 550 nm で R ≧ 90%、Tave ≧ 90 %（570 ～ 600 nm で）、M4: IA = 45°、R ≥ 90%（560 ～ 570 nm で）、Tave ≥ 90%（590 ～ 600 nm で）、M5: IA = 45°、R ≥ 98%（580 ～ 600 nm で） 、680 ～ 700 nm で R ≧ 98%、M6: IA = 45°、600 ～ 610 nm で Tave ≧ 90%、630 ～ 700 nm で R ≧ 90%、M7: IA = 45°、R ≧ 90% 620 ～ 630 nm、650 ～ 700 nm で Taw ≧ 90%、M8: IA = 45°、640 ～ 650 nm で R ≧ 90%、670 ～ 700 nm で Taw ≧ 90%、M9: IA = 45°、R 650 ～ 670 nm で ≥ 90%、690 ～ 700 nm で Tave ≥ 90%、BP: IA = 0°、505 nm で T ≤ 0.01%、530 nm で Tave ≥ 95%、530 nm で Tave ≥ 90% -690 nm で T ≤ 1%、725 ～ 750 nm で T ≤ 1%。ここで、IA、T、Tave、R は入射角、透過率、平均透過率、非偏光反射率です。
LED光源（AS 3000、アズワン株式会社）から発せられた波長範囲400〜750 nmの白色光（C0）をコリメートし、ダイクロイックミラーアレイのDPに垂直に入射しました。LEDの白色光スペクトルを補足図S3に示します。アクリル タンク (寸法 150 × 150 × 30 mm) を、PSU の反対側のデカカメラ ミラー アレイの直前に置きます。ドライアイスを水に浸したときに発生した煙をアクリルタンクに注ぎ、十色鏡のアレイから発せられる 9 色の C1 ～ C9 の分かれた流れを観察しました。
あるいは、平行白色光 (C0) は、DP に入る前にフィルターを通過します。フィルターは元々、光学濃度 0.6 の減光フィルターでした。次に、電動フィルター (FW212C、FW212C、Thorlabs) を使用します。最後にNDフィルターをオンに戻します。9 つのバンドパス フィルターの帯域幅は、それぞれ C9、C8、C7、C6、C5、C4、C3、C2、C1 に対応します。内部寸法 40 (光学長) x 42.5 (高さ) x 10 mm (幅) の石英セルを、BP の反対側の減色ミラーのアレイの前に配置しました。次に、煙はチューブを通して石英セルに供給され、石英セル内の煙の濃度を維持し、デカクロマティックミラーアレイから発せられる 9 色の C1 ～ C9 スプリットストリームを視覚化します。
一連のデカニックミラーから発せられる 9 色の分割光の流れのビデオが、iPhone XS のタイムラプス モードで撮影されました。シーンの画像を 1 fps でキャプチャし、画像をコンパイルして 30 fps (オプションのビデオ 1 の場合) または 24 fps (オプションのビデオ 2 および 3 の場合) でビデオを作成します。
拡散板上に厚さ 50 μm のステンレス板（直径 50 μm の穴が 1 mm 間隔で 4 つある）を置きます。ハロゲンランプからの光をカットオフ波長700nmの短透過フィルターを通過させ、波長400～750nmの光を拡散板に照射します。光のスペクトルを補足図S4に示します。あるいは、光は、530、550、570、590、610、630、650、670、および 690 nm を中心とする 10 nm バンドパス フィルターの 1 つも通過し、拡散板に当たります。その結果、拡散板と対向するステンレス板上に、直径φ50μmで波長の異なる4つの放射点が形成された。
図 1 と図 2 に示すように、4 つのレンズを備えた 4 つのキャピラリー アレイが 9 色分光計に取り付けられています。C1 と C2。4 つの毛細管と 4 つのレンズは以前の研究と同じでした 31,34。波長505nm、出力15mWのレーザー光を4本のキャピラリーの発光点に側面から同時に均等に照射します。各発光点から発せられた蛍光は、対応するレンズによってコリメートされ、デカクロマティックミラーのアレイによって 9 つのカラーストリームに分離されます。得られた 36 ストリームを CMOS イメージセンサー (C11440-52U、浜松ホトニクス株式会社) に直接入力し、同時に画像を記録しました。
ABI PRISM® BigDye® Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems)、4 µl GeneScan™ 600 LIZ™ 色素を、1 µl PowerPlex® 6C Matrix Standard (Promega Corporation)、1 µl ミックスサイズ標準と混合することにより、キャピラリーごとに混合しました。v2.0 (Thermo Fisher Scientific) および 14 µl の水。PowerPlex® 6C Matrix Standard は、最大波長の順に FL-6C、JOE-6C、TMR-6C、CXR-6C、TOM-6C、WEN の 6 つの色素で標識された 6 つの DNA フラグメントで構成されています。これらのDNA断片の塩基長は開示されていないが、WEN、CXR-6C、TMR-6C、JOE-6C、FL-6C、TOM-6Cで標識されたDNA断片の塩基長配列は既知である。ABI PRISM® BigDye® Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit の混合物には、dR6G 色素で標識された DNA フラグメントが含まれています。DNA断片の塩基長も開示されていない。GeneScan™ 600 LIZ™ Dye Size Standard v2.0 には、36 個の LIZ 標識 DNA フラグメントが含まれています。これらのDNA断片の塩基長は、20、40、60、80、100、114、120、140、160、180、200、214、220、240、250、260、280、300、314、320、340、 360、380、400、414、420、440、460、480、500、514、520、540、560、580、600ベース。サンプルを94℃で3分間変性させ、その後氷上で5分間冷却した。サンプルは、26 V/cm で 9 秒間各キャピラリーに注入され、有効長 36 cm、電圧 181 V/cm の POP-7™ ポリマー溶液 (Thermo Fisher Scientific) で満たされた各キャピラリー内で分離されました。角度60°。から。
この研究の過程で取得または分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその追加情報に含まれています。この研究に関連するその他のデータは、合理的な要求に応じて各著者から入手できます。
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投稿日時: 2023 年 1 月 10 日